在正常情况下，细胞的生长、代谢、增殖和分化均受机体有序调控，但当细胞发生癌变时则不受机体控制，导致其恶性增殖分化，严重影响机体正常生理和代谢功能，最终导致机体死亡。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其所致死亡率位居所有恶性肿瘤的第二位。目前治疗肝癌的主要手段包括手术、放疗和化疗。手术虽可局部切除肿瘤，但不能根除肿瘤细胞，疾病复发的概率非常高；放、化疗对局部肿瘤有效，对转移性病灶难以发挥有效的治疗作用，同时会对患者正常细胞和组织造成不可逆伤害，产生诸多的不良反应和副作用。因此，从天然产物中寻找高效、毒副作用小的预防和治疗肝癌的活性成分成为当今研究的热点之一。
山西大学分子科学研究所，中医药现代研究中心的田艳花、张立伟*等人以君迁子叶为原料，通过分离纯化获得高纯度的杨梅苷单体，采用噻唑蓝（MTT）法测定不同浓度杨梅苷在不同处理时间下对HepG2细胞存活率的影响，并通过激光共聚焦显微镜结合Hoechst染色观察经杨梅苷处理后的HepG2细胞的形态变化；此外，利用流式细胞分析仪检测杨梅苷对HepG2细胞凋亡、周期阻滞、胞内活性氧（ROS）水平及单丹璜酰戊二胺（MDC）平均荧光强度的影响；最后通过Westernblot检测不同浓度杨梅苷对HepG2细胞凋亡和自噬相关蛋白表达量的影响，以期明确杨梅苷抗肝癌活性及其作用机制。
1、不同浓度杨梅苷对L-02和HepG2细胞存活率的影响
由图2A可知，用10～μmol/L的杨梅苷处理正常肝细胞（L-02细胞）24、48h和72h，L-02细胞存活率均无显著变化（P＞0.05），表明杨梅苷在10～μmol/L的浓度范围内对正常肝细胞（L-02）无损害作用。通过倒置显微镜进一步观察L-02细胞形态，发现10～μmol/L的杨梅苷处理L-02细胞后，细胞的形态和数量与对照组相比均未发生明显变化（图2B），进一步证明杨梅苷在浓度为10～μmol/L下对正常肝细胞无毒。进一步研究在该浓度（10～μmol/L）范围内杨梅苷对人肝癌细胞（HepG2细胞）存活率的影响，由图2C可知，在处理时间相同的情况下，不同浓度的杨梅苷对HepG2细胞存活率影响显著不同（P＜0.05），随杨梅苷浓度的增加，HepG2细胞存活率呈显著降低趋势（P＜0.05），且呈浓度依赖关系。另一方面，相同浓度的杨梅苷分别处理HepG2细胞24、48、72h后，HepG2细胞存活率显著不同（P＜0.05），处理24h的HepG2细胞存活率显著高于48h和72h（P＜0.05），处理48h和72h的HepG2细胞存活率无显著差异（P＞0.05）。通过回归拟合分析得到杨梅苷处理HepG2细胞24、48、72h后的IC50分别为.99、.41、.81μmol/L，结果表明同浓度的杨梅苷处理细胞时间越长，IC50越小，对HepG2细胞的杀伤能力越强。MTT实验结果显示杨梅苷对人肝癌HepG2细胞的生长有显著的抑制作用，其抑制作用与杨梅苷浓度和作用时间呈正相关。
2、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞内ROS水平的影响
为进一步探究杨梅苷是否能引起HepG2细胞内ROS水平的变化，本研究利用DCFH-DA荧光探针检测不同浓度杨梅苷对HepG2细胞内ROS水平的影响，其平均荧光强度可直观反映胞内ROS水平，结果如图3所示。不同浓度杨梅苷（10～μmol/L）处理HepG2细胞，其胞内ROS水平显著高于对照组（P＜0.05），且杨梅苷浓度越大，HepG2细胞内ROS水平越高。表明杨梅苷能显著提高HepG2细胞内ROS水平，进而诱发细胞凋亡。
3、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞形态的影响
为进一步验证杨梅苷是否能够诱导HepG2细胞凋亡，本实验采用Hoechst染色法对HepG2细胞进行染色，利用激光共聚焦显微镜观察染色后的HepG2细胞形态，结果如图4所示。与对照组相比，杨梅苷（10～μmol/L）干预后的HepG2细胞数量明显减少，不规则细胞数增多，细胞核的蓝色荧光强度明显增强。表明杨梅苷可通过诱导HepG2细胞凋亡而抑制其生长，从而达到抗肝癌的效果。
4、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞凋亡率的影响
本研究在MTT和Hoechst实验的基础上，采用流式细胞分析仪进一步探究不同浓度杨梅苷对HepG2细胞凋亡率的影响，结果如图5所示。随杨梅苷浓度增加，HepG2细胞凋亡率显著增加（P＜0.05），且呈浓度依赖效应。当杨梅苷浓度为10、50、、μmol/L时，HepG2细胞凋亡率分别为（15.14±1.05）%、（25.74±1.38）%、（35.16±2.04）%和（55.75±1.99）%，与对照组相比，凋亡率分别增加12.60%、23.20%、32.62%和53.21%。表明杨梅苷可抑制HepG2细胞增殖，加速细胞凋亡，且浓度越大，促凋亡效果越显著。
5、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞周期的调控
为探究杨梅苷对HepG2细胞的生长抑制是否与细胞周期阻滞有关，本研究考察了不同浓度杨梅苷对HepG2细胞周期分布规律的影响，结果如图6所示。当杨梅苷浓度在10～μmol/L时，随杨梅苷浓度增加G0/G1期的细胞比例显著降低（P＜0.05），而G2/M期的细胞比例显著增加（P＜0.05），且呈浓度依赖性。当杨梅苷浓度为50μmol/L和μmol/L时，S期细胞比例无显著差异（P＞0.05），而高浓度（μmol/L）杨梅苷处理的HepG2细胞，其S期细胞比例均显著高于对照组和低浓度杨梅苷处理组（P＜0.05）。实验结果表明杨梅苷对HepG2细胞周期有调控作用，可将细胞周期阻滞在G2/M期，高剂量的杨梅苷还可使HepG2细胞阻滞于S期，从而抑制HepG2细胞的增殖。
6、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞自噬的影响
本研究采用MDC染色法检测不同浓度杨梅苷对HepG2细胞内平均荧光强度的影响，其结果如图7所示。与对照组相比，样品组HepG2细胞中MDC平均荧光强度随杨梅苷浓度的增加显著增强（P＜0.05），当杨梅苷浓度为10、50、、μmol/L时，HepG2细胞中MDC平均荧光强度较对照组分别提高了0.26、0.43、0.74、1.20倍。表明杨梅苷可诱导HepG2细胞自噬，从而抑制HepG2细胞增殖。
7、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响
为进一步探究杨梅苷对HepG2细胞抗肿瘤作用的分子机制，采用Westernblot检测不同浓度杨梅苷对凋亡相关蛋白表达量，结果如图8所示。与对照组相比，杨梅苷实验组中Bax、细胞色素c、Caspase-9和Caspase-3相对表达量均显著上调（P＜0.05），50、、μmol/L杨梅苷实验组中Apaf-1相对表达量均显著上调（P＜0.05）；杨梅苷实验组Bcl-2相对表达量显著下调（P＜0.05），且呈浓度依赖性。以上结果表明杨梅苷能激活线粒体介导的凋亡通路，上调促凋亡相关蛋白表达水平，下调抑制凋亡的相关蛋白表达水平，进而抑制HepG2细胞增殖，加速细胞凋亡，起到抗肝癌的作用。
8、不同浓度杨梅苷对HepG2细胞自噬相关蛋白表达量的影响
LC3-I和LC3-II是自噬体经典的标志蛋白，在自噬发生过程中，LC3-I转化为LC3-II。本研究进一步采用Westernblot检测杨梅苷处理的HepG2细胞自噬相关蛋白表达量，其结果如图9所示。与对照组相比，不同浓度杨梅苷（10～μmol/L）处理的HepG2细胞的Beclin1、Atg5和LC3-II相对表达量显著上调（P＜0.05），而LC3-I相对表达量显著下调（P＜0.05）。除杨梅苷浓度为10μmol/L和50μmol/L时Atg5相对表达量无显著差异（P＞0.05）外，其余细胞自噬相关蛋白表达量均与杨梅苷浓度呈正相关。以上结果进一步证实杨梅苷可促进HepG2细胞自噬，从而抑制HepG2细胞增殖，达到抗肝癌的作用。
通过上述结果可知，当HepG2细胞受到杨梅苷干预后，细胞内ROS水平提升，诱导HepG2细胞形态发生变化，Hoechst染色结果证实杨梅苷处理后HepG2细胞核具有较强的蓝色荧光，流式细胞仪检测结果显示杨梅苷均能显著提高HepG2细胞的凋亡率和胞内MDC平均荧光强度，并将HepG2细胞周期阻滞在G2/M期，从而抑制HepG2细胞增殖；Westernblot结果表明杨梅苷能上调Bax、细胞色素c、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3、Beclin1、Atg5和LC3-II的相对表达量，下调Bcl-2和LC3-I的相对表达量，表明杨梅苷的抗肝癌机制与激活线粒体介导的凋亡通路、细胞周期阻滞和提升胞内ROS水平和促进细胞自噬有关。杨梅苷诱导HepG2细胞凋亡和自噬的途径如图10所示。结论
本研究结果表明杨梅苷可通过激活线粒体介导的细胞凋亡通路、阻滞细胞周期、提升胞内ROS水平并促进细胞自噬来诱导人肝癌HepG2细胞凋亡，降低其存活率，从而起到抗肝癌作用。研究结果可为杨梅苷作为天然抗肝癌药物的开发提供理论参考。本文《君迁子叶杨梅苷诱导HepG2细胞凋亡及其作用机制》来源于《食品科学》年42卷11期-页，作者：田艳花，吴磊，杜会枝，杨兆艳，张立伟。DOI:10./spkx2--20609-。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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